Ученые из Института биохимии в Швейцарии описали в статье журнала Molecular Biology of the Cell ранее неизвестную органеллу. Обнаруженный «микроконтейнер» изолирует чужую ДНК, которая попадает в клетку с инфекционными агентами (бактериями, ДНК-содержащими вирусами) или вводится искусственно в экспериментальных и терапевтических целях.
Новый компартмент назвали эксклюсомой (от excluding — исключать и cytosome — мелкая гранула в эукариотической клетке).
Последние 50 лет ученые экспериментируют с внедрением кольцевой, или плазмидной, ДНК в эукариотические клетки. Это ключевой процесс в молекулярной биологии — его применяют в разработке лекарств, генной терапии и производстве вакцин. Кольцевую ДНК помещают в клеточную цитоплазму, чтобы запустить экспрессию рекомбинантных генов и синтезировать белок с заданными свойствами. Доставить ДНК в клетку можно разными способами: химическими, прямой инъекцией в ядро или с помощью электропорации. Но при любом из методов белок синтезируется очень недолго, и это ограничивает применение технологии. Над решением этой проблемы работали многие биологи, и только нескольким группам удалось приблизиться к ответу на вопрос: почему так происходит.
В 2005 году ученые из Университета Хиросимы поместили плазмиду в клеточное ядро эукариот и наблюдали, что с ней случится. До их эксперимента защитная реакция клетки на постороннюю ДНК была хорошо изучена лишь у прокариот (бактерий).
Японские исследователи снабдили плазмиды флуоресцентными метками и микроинъекциями внедрили их в ядро мышиных клеток и клеток человеческой аденокарциномы. Ученые увидели, что кольцевые ДНК всегда мигрируют из ядра в цитоплазму и сохраняются там в неизменном виде долгое время — иногда до года. Тогда они предположили, что есть какая-то транспортная система, которая переносит чужую ДНК из клеточного ядра в цитоплазму.
Спустя десять лет, в 2015 году, другой японский коллектив из Университета Осаки изучил механизмы захвата чужой ДНК. Исследователи выяснили, что сразу после внедрения плазмиды в цитоплазму человеческой клетки ее захватывает белок BAF. Он подавляет репликацию инородной ДНК и экспрессию генов с плазмиды. Ученые также заметили мембрану вокруг плазмиды — по структуре та была похожа на ядерную оболочку.
Накопление BAF и сборка мембраны вокруг кольцевой ДНК. Большое пятно — ядро, маленькое — плазмида, окрашивающаяся зеленым
Kobayashi S. et al./ Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015
В 2016 году миграцией плазмидной ДНК в эукариотических клетках заинтересовались в Швейцарии. Исследованиями занялась группа ученых под руководством Рут Крошевски (Ruth Kroschewski) из Института биохимии. Швейцарцы увидели, что сгруппированные плазмиды в цитоплазме физически связаны с мембраной эндоплазматического ретикулума и остаются относительно неподвижными даже во время клеточного деления.
В 2023 году группа Крошевски подробно описала изоляцию чужеродной ДНК в живой клетке. Биологи встраивали искусственные плазмиды в различные клеточные линии млекопитающих — так можно показать, что у разных видов процесс протекает одинаково. Чтобы увидеть кольцевую ДНК под микроскопом, в нее предварительно вставляли гены для производства флуоресцентных белков GFP и mCherry. Когда плазмида попадала в цитоплазму, клеточные ферменты начинали с ДНК-вставки биосинтез флуоресцентного белка, который подсвечивал молекулы ДНК. После этого плазмиды становились видимыми в микроскоп.
Сутки исследователи наблюдали за светящимися островками в клеточных линиях: флуоресценция появлялась в разных областях клетки, но никогда не сливалась воедино, будто этому мешала невидимая оболочка. Также кольцевые ДНК при попадании в ядро всегда мигрировали в цитоплазму — это был тот же эффект, что обнаружила группа ученых из Университета Хиросимы почти 20 лет назад.
Эксклюсома (визуализирована зеленым)
Schenkel L. et al. / Molecular Biology of the Cell, 2023
Швейцарцы исследовали структуру с помощью корреляционной свето-электронной микроскопии — в методе совмещают фотографии со светового и электронного приборов. На снимках ученые увидели вокруг плазмиды двойную мембрану, подтвердив результаты исследователей из Осаки. Это стало доказательством существования новой органеллы, которой теперь дали название эксклюсома. Но транспортной системы — белков-транспортеров, наличие которых предсказывали ученые из Хиросимы, — швейцарские биологи пока не нашли.
Двойная мембрана вокруг плазмиды (отмечена желтыми стрелками)
Schenkel L. et al. / Molecular Biology of the Cell, 2023
Группа Крошевски тщательно изучила состав мембраны нового компартмента. Выяснилось, что эксклюсома и ядро похожи по составу. Наблюдая в конфокальный микроскоп иммуноокрашенные образцы, ученые узнали, что мембрана эксклюсомы состоит из белков эндоплазматического ретикулума и белков внутренней ядерной мембраны — Lap2β и эмерина. Это роднило новую органеллу с ядром, но было важное отличие: она оказалась герметичной. В оболочке эксклюсомы не было рецептора ламина Б, белков комплекса ядерной поры и самих пор, через которые молекулы перемещаются между ядром и цитоплазмой.
Что касается белков комплекса ядерной поры, то у эксклюсомы при сборке не оказалось этапа их встраивания в мембрану. А это чрезвычайно важный этап в формировании ядра клетки во время ее деления, потому что именно белки комплекса ядерной поры задействованы в ключевом этапе синтеза белка — транскрипции, — где выполняют транспортную функцию для мРНК. По всей видимости, из-за отсутствия белков комплекса ядерной поры в оболочке эксклюсомы экспрессия плазмидных генов так быстро прекращается.
Биологи предположили, что эксклюсома нейтрализует не только постороннюю ДНК, но и вообще весь «ДНК-мусор» в цитоплазме. Свою гипотезу они проверили на плазмидах теломерного происхождения.
Хромосомная, важная для клетки ДНК, всегда упаковывается только в ядро в конце митоза. Но в эукариотической клетке есть и свой генетический мусор, такая ДНК периодически отрывается от теломер и замыкается в кольца. Есть гипотеза, что эти теломерные плазмиды участвуют в образовании раковых опухолей. Но куда в точности направляются кольцевые ДНК, оторвавшись от теломер, и что с ними дальше происходит, никто не знал.
Группа Крошевски заполнила и этот пробел. Ученые использовали метод FISH, чтобы изучить миграцию теломерных плазмид. Для эксперимента взяли олигонуклеотидные зонды, специфичные к такой ДНК. Когда зонды связывались с теломерами (лишние зонды при этом «вымывали» из клетки), пары «зонд — теломерная ДНК» наблюдали в флуоресцентный микроскоп. На снимках исследователи разглядели, как эксклюсома захватывает мусорную ДНК и удерживает ее своей оболочкой.
Фрагменты теломерной ДНК в эксклюсоме
Schenkel L. et al. / Molecular Biology of the Cell, 2023
После этого сомнений не осталось: швейцарцы не только нашли новую органеллу, но и приблизились к пониманию «выключения» плазмидных генов. Правда, многие вопросы пока остались без ответа. Ученым еще предстоит понять, как клетка узнает и отличает чужую генетическую информацию от своей хромосомной ДНК и какие ферменты участвуют в упаковке плазмид. Но вопрос, как продлить синтез полезных белков в клеточных культурах, по-прежнему остается открытым.