Американские исследователи Pujuan Deng, Hyunbin Lee, Carlo Armijo, Haoqing Wang, Alex Gao изучали очень распространенную у бактерий систему защиты от бактериофагов. Одним из ферментов этой системы является обратная транскриптаза DRT3 (Defense-associated reverse transcriptase 3). Она состоит из двух субъединиц: Drt3a и Drt3b, а также некодирующей РНК.
Инкубирование данного ферментного комплекса in vitro (в пробирке) с дезоксирибонуклеотидами (то есть «кирпичиками» ДНК) приводит к образованию ДНК разной длины — вплоть до нескольких тысяч нуклеотидов.
Для того, чтобы понять, какая именно получается ДНК (одноцепочечная или двуцепочечная, связана она с белком или нет), авторы обработали продукт разными ферментами: один из них разрушает только одноцепочечную ДНК (S1-нуклеаза), а другой — только двуцепочечную (ДНКаза). Эксперименты проводили также в присутствии и отсутствии протеиназы K, которая расщепляет белки. В результате оказалось, что DRT3 синтезирует смесь одно- и двуцепочечной ДНК. При этом часть одноцепочечной ДНК ковалентно соединена с белком и становится доступной для S1-нуклеазы только после того, как белок удаляют.
Далее, чтобы понять как устроен комплекс DRT3 и как в нем происходит синтез ДНК, авторы определили его структуру с помощью метода криоэлектронной микроскопии (cryo-EM). В результате авторам удалось увидеть, как устроены обе субъединицы DRT3, Drt3a и Drt3b, и как они взаимодействуют с некодирующей РНК и где именно находится синтезируемая ДНК.
Когда авторы посмотрели на Drt3a, там все оказалось обычно: этот фермент синтезирует одноцепочечную поли-ГТ-ДНК, используя в качестве матрицы некодирующую РНК в своем составе (рис. 1).
Рисунок 1. Структурная организация субъединицы Drt3a Escherichia coli по данным криоэлектронной микроскопии (cryo-EM). Субъединица Drt3a имеет в составе некодирующую РНК, которая используется в качестве матрицы при синтезе новой цепи ДНК, что демонстрирует классический, матрично-зависимый механизм синтеза.
А вот Drt3b оказался принципиально другим: он синтезирует одноцепочечную поли-АЦ-ДНК. Но в его активном центре нет привычной матрицы из нуклеотидов. Вместо этого растущая цепь ДНК напрямую взаимодействует с самим белком. Аминокислотные остатки в нем расположены так, что фактически «играют роль матрицы»: за счет водородных связей и пространственной геометрии они направляют присоединение определенных нуклеотидов в нужном порядке.
Рисунок 2. Структурная организация субъединицы Drt3b Escherichia coli по данныкриоэлектронной микроскопии (cryo-EM). Слева представлено сравнение с обратной транскриптазой group II интрона Geobacillus stearothermophilus. В области, где у классических ферментов располагается нуклеотидная матрица для синтеза ДНК, у Drt3b выявлены аминокислотные остатки, образующие водородные связи и формирующие белковую матрицу. Справа показана схема взаимодействий между аминокислотными остатками Drt3b и последними шестью основаниями на 3′-конце синтезируемого ДНК-продукта.
Это наблюдение подтвердили эксперименты с заменой одной из ключевых аминокислот в белке Drt3b. При внесении такой замены, вместо аденозина (A) в цепь начал частично встраиваться гуанозин (G). Это доказывает, что именно белок, а не ДНК или РНК, задает выбор встраиваемого нуклеотида.
Итак, длинная, строго определенная — хотя и простая ДНК может синтезироваться на белке.